【产品名称】

　　通用名称：肠道病毒核酸检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)

　　【包装规格】50人份/盒

　　【预期用途】

　　本试剂盒用于体外定性检测人的咽拭子中的肠道病毒核酸。

　　手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)主要是由肠道病毒感染引起的急性传染病[1]，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患者发病后迅速累及神经系统，表现为脑干脑炎、脑脊髓炎、脑脊髓膜炎等，发展为循环衰竭、神经源性肺水肿的患儿病死率高[2]。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型，均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV 71)最为常见[3-4]。

　　本试剂盒为手足口病患者的诊断提供辅助手段。检测结果仅供临床参考，最终诊断应紧密结合其他临床指标综合考虑。

　　【检测原理】

　　本试剂盒采用酶切探针恒温扩增技术(Enzymatic Probe Isothermal Amplification，EPIA)，针对EV的高度保守区域设计特异性引物与含RNA碱基的探针(rProbe)，同时加入Bst酶、RNaseH和逆转录酶等，其中rProbe的RNA碱基左、右两端分别标记荧光基团和淬灭基团。首先将提取的RNA逆转录为cDNA，利用Bst酶的DNA聚合酶活性和链置换活性扩增待测靶标，RNaseH酶可切割靶标-探针杂交链上的RNA碱基，使得rProbe的荧光基团和淬灭基团分离从而发出荧光。此外，残留的rProbe RNA碱基左侧片段可作为引物继续延伸形成产物，使得产物进一步累积。荧光信号随着产物的形成不断累积，从而实现对目标核酸的检测。

　　【主要组成成分】

　　注：不同批号产品的组分之间不可以混用或互换。

　　需自备试剂：天根生化科技(北京)有限公司的病毒RNA提取试剂盒(DP315-R)，或江苏宏微特斯医药科技有限公司的核酸提取试剂(HWTS-3001)。

　　自备试验材料：1.5mL无RNase和DNase的离心管、无RNase和DNase Tip头、台式离心机、台式震荡混合器。

　　【储存条件及有效期】

　　本试剂盒于-18℃以下保存，试剂盒有效期为9个月。反复冻融次数不得多于4次，在-18℃以下的避光条件下运输，可稳定保存5天。

　　生产日期及有效期见包装标签。

　　【适用仪器设备】

　　ABI 7500荧光定量PCR仪、上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪

　　【样本要求】

　　样本采集

　　新鲜采集的咽拭子。

　　咽拭子样本采集：用聚酯纤维头拭子适度用力多次抹擦悬雍垂(腭垂或小舌)后部咽后壁及双侧扁桃体，避免触及舌部，取出后置采样管，折断手接触部位的塑料柄，使拭子浸泡至采样液中，旋紧管盖。

　　储存

　　待测样本在2~8℃保存不超过6天，-18℃以下保存不超过3个月， -70℃以下条件样本长期保存、样本应避免反复冻融，反复冻融次数不超过4次。

　　运输

　　采用泡沫箱加干冰密封进行运输，运输时间最多不超过5天。

　　【检验方法】

　　扩增试剂准备

　　从试剂盒中取出EV核酸反应液及EV检测酶液，待其溶解后，振荡混匀，瞬时离心。根据所需样本数目n，计算需准备样品数n(n=样本数+阴性对照品+阳性照品)，按照下表配制扩增试剂，混匀短暂离心后分装到八联反应管中。用毕的EV核酸反应液及EV检测酶液立即放入-18℃以下冻存。

1. 样本处理
2. 取1.5mL无RNase和DNase离心管，依次标记为阴性对照品、待测样本、阳性对照品，严格按照推荐的核酸提取试剂的说明书进行后续的样本RNA提取，（阳性对照品及阴性对照品需与样本等量同时提取）。
3. 提取的RNA样本应立即用于检测或-70℃以下保存。
4. 加样

在所设定好的每个反应管中分别依次加入步骤2中处理过的待测样本的RNA及阴性对照品、阳性对照品各10µL，盖紧管盖，简短离心。

1. 实时恒温扩增
2. 仪器通道及反应体积选择
3. 选择FAM通道（Reporter： FAM， Quencher： None）检测肠道病毒核酸；
4. 反应体积（Sample Volume）为30µL。具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
5. 实时恒温扩增条件设定

　　结果分析

　　Tt 值：每个反应管内的扩增曲线与阈值线交点的横坐标读数。

　　ABI7500荧光定量PCR仪基线及阈值设定方法

　　基线(baseline)设定：基线(baseline)设定：使用默认基线，若样本中最小Tt值<默认基线终点，需根据实际结果进行调整，具体如下：设定某通道基线时，首先选中最小Tt值的待检样本，将选项“☑Auto Baseline”改为“□Auto Baseline”，然后选中☑Baseline Start，手动调整基线终点至小于样本最小Tt值即可。。

　　阈值(threshold)设定：设定某通道阈值线时，首先选中检测的阴性对照品，去掉勾选的自动阈值线，将选项“☑Auto线改为“□Auto”，然后手动调整阈值线，FAM通道以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

　　上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪基线及阈值设定方法

　　基线(baseline)设定：在“创建项目”→“实验参数”中的基线起点设为1，终点设为2。若待检样本中最小Tt值<2，需根据实际结果进行调整。具体如下：设定某通道基线时，将“基本参数”中的 “基线终点”调至小于Tt值即可。

　　阈值(threshold)设定：设定某通道阈值线时，首先将 “基本参数”中的“基线优化”设定为手动优化，然后手动调整阈值线，以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

1. 质量控制：
2. 阴性对照品：应无明显扩增曲线或无数值。
3. 阳性对照品：应有明显扩增曲线且Tt值应不大于28。

　　以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

　　【阳性判断值或参考区间】

　　采用ROC曲线分析的方法对试剂盒检测的临界值进行分析。确定本试剂盒检测肠道病毒的阳性判断值为Tt值<30。

　　【检验结果的解释】

　　如果检测样本有明显扩增曲线，且Tt值<30，则判断为肠道病毒阳性。

　　如果检测样本无扩增信号，则判断为肠道病毒检测阴性。

　　【检验方法的局限性】

1. 本试剂盒检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
2. 不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果。
3. 扩增产物的污染和核酸提取中样本间的交叉污染很容易出现假阳性结果，因此临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员，应严格按照说明书要求进行操作。
4. 检测为阴性，并不代表该患者为非肠道病毒感染患者，具体诊断结果须结合其他临床诊断结果判断。造成检测为阴性的可能是：①不合理样本采集、转运及处理、样本中核酸含量过低导致检测失败或结果不准确；②检测的靶序列区域出现变异或者其他原因导致的序列改变可能会导致不准确结果；③未经验证的其他干扰因素或者核酸反应抑制因子也可能导致不准确结果等。

　　【产品性能指标】

1. 试剂盒外观完好，液体组分清亮、透明、无不溶物。
2. 试剂盒检测阴性对照品应无明显扩增曲线或无数值；检测阳性对照品应有明显扩增曲线且Tt值不大于28。
3. 试剂盒检测企业阳性参考品P1-P4均为阳性。
4. 试剂盒检测企业阴性参考品N1~N6均为阴性。
5. 试剂盒检测企业检测限为5copies/uL。
6. 重复性：检测重复性参考品CV≤10.0％（n=10）。
7. 试剂盒特异性：使用试剂盒检测其他呼吸道病原体如甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎克雷伯菌、诺如病毒、轮状病毒、EB病毒、巨细胞病毒、肺炎链球菌、鼻病毒、麻疹病毒、B族链球菌、沙门菌、志贺菌及正常人咽拭子样本等结果均为阴性。

　　【注意事项】

　　1. 肠道病毒感染患者的样品具有传染性，样品的采集、保存、运输、处理实验应遵循国家相应的管理规范和生物安全条例，进行样本处理时必须做好相关的保护措施，确保实验人员安全。

　　2. 本试剂盒结果会受到样品本身的来源、样品采集过程、样本质量、样本运输条件、样本预处理等因素影响，同时也受到RNA提取质量、荧光定量PCR仪工作状态、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等限制，可能导致得出假阳性或假阴性的检测结果。使用者须了解检测过程中可能存在的潜在错误、准确性的局限性。

　　3. 试剂盒应低温运输和保存，试剂盒内各试剂使用前，充分融化并振荡均匀后请短暂离心。避免在不必要的情况下反复冻融。

　　4. 本试剂盒所有试剂均经过特别配制，以用于上述检测。随意替换试剂盒中的任何试剂，都可能影响使用效果。不同批号试剂盒成分不可相互混用。

　　5. 实验请严格分区操作：

　　第一区：试剂准备区——准备扩增所需试剂;

　　第二区：样本处理区——待测样本处理;

　　第三区：检测区——扩增检测。

　　有关实验室管理规范严格按照行政主管部门颁布的有关基因扩增检测实验室的管理规定执行。

　　各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染;实验后即请清洁工作台。在−18℃以下或−70℃以下保存的样品裂解产物，应在加样前置室温解冻，作短暂离心后使用。

　　6. 实验时注意防止外源核酸对试剂的污染，注意先加完样品RNA后再进行阳性对照的操作。推荐在制备反应试剂和添加RNA模板时，使用单独、专用的移液枪和枪头。

　　7. 分装有反应液的反应管应扣盖或装入密封袋内再转移至样本处理区。

　　8. 反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

　　9. 加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品黏附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。

　　10. 扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。

　　11. 实验中所用的离心管、Tip头必须保证无RNase和DNase。实验中所用过的离心管、Tip头必须无害化处理。实验中用过的吸头请直接打入盛有84消毒液的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

　　12. 工作台及各种实验用品定期用75%酒精或紫外灯进行消毒。

　　13. 所有化学药品都具有潜在的危险性。操作时，请穿着合适的实验室工作服、并佩戴一次性手套等防护性措施。使用过的试剂盒为临床废弃物，应该妥善处理。

　　【参考文献】

　　陶建平, 杨思达, 邓力, et al. 重症手足口病的诊断与治疗[J]. 中国实用儿科杂志, 2009, 24(6):423-426.

　　《手足口病诊疗指南(2018版)》编写专家委员会. 手足口病诊疗指南(2018年版)[J]. 中华传染病杂志, 2018, 36(5):257-263.

　　邱宝强, 颜云盈. 手足口病病原学研究进展[J]. 广西医学, 2016, 38(5):698-700.

　　Xiao X, He Y, Yu Y, et al. Simultaneous detection of enterovirus 71 and coxsackievirus A16 by multiplex real-time PCR with an internal control[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2009.

　　【基本信息】

　　注册人/生产企业名称：江苏宏微特斯医药科技有限公司

　　住所：江苏省如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园)

　　售后服务单位：江苏宏微特斯医药科技有限公司

　　联系方式：

　　电话：0513-80562880

　　传真：0513-80562881

　　邮编：226400

　　网址：http://www.hongweitest.com/

　　生产地址：江苏省如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园10号楼一层)

　　生产日期、生产批号及有效期至见产品包装盒

　　[医疗器械生产许可证编号]

　　[医疗器械注册证编号/产品技术要求编号]

　　[说明书核准日期及修改日期]