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B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)

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所属分类:生殖健康检测

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B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)

本试剂盒用于体外定性检测妊娠35~37周高危因素的孕妇,有胎膜早破、先兆早产等临床症状的其他孕周数孕妇的直肠拭子、阴道拭子或直肠/阴道混合拭子样本中B族链球菌核酸DNA。
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0513-80562880
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产品简介

【产品名称】
通用名称:B族链球菌核酸检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)
【包装规格】 50人份/盒
【预期用途】
本试剂盒用于体外定性检测妊娠35~37周高危因素的孕妇,有胎膜早破、先兆早产等临床症状的其他孕周数孕妇的直肠拭子、阴道拭子或直肠/阴道混合拭子样本中B族链球菌核酸DNA。
B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS)又称无乳链球菌(streptococcus agalatiae)是一种正常寄居于人体下消化道及泌尿生殖道的革兰氏阳性条件致病菌,大约10%-30%的孕妇有GBS阴道寄居[1]。孕期妇女因体内激素水平的变化使生殖道的内环境发生改变而易感染GBS,从而引起孕妇发生早产、胎膜早破、死胎等不良妊娠结局,还可导致孕妇发生产褥感染[2-3]。此外,感染GBS的产妇在经产道分娩的过程中,40%-70%会将GBS传染给新生儿,引发新生儿败血症及脑膜炎等严重的新生儿感染性疾病[4],如果新生儿携带了GBS,大约有1%-3%会出现早期侵入性感染,其中有5%会导致死亡。新生儿B族链球菌与围生期感染相关,是新生儿败血症、脑膜炎等严重感染性疾病的一个重要病原菌[5]。本试剂盒通过准确诊断B族链球菌的感染,最大程度减少其引发孕妇和新生儿的发生率和危害以及由此危害造成的不必要经济负担。
本试剂盒为围产期孕妇GBS感染的诊断提供辅助手段。检测结果仅供临床参考,最终诊断须紧密结合其他临床指标综合分析。
【检测原理】
【主要组成成分】


编号

组成成分(50人份/盒)

规格

数量

组成说明

1

GBS核酸反应液

900µL /支

1支

恒温扩增反应buffer、dNTP、水及引物等

2

GBS检测酶液

160µL /支

1支

恒温扩增Bst酶及探针、RNaseH等

3

GBS阳性对照品

1mL/支

1支

106Copies/mL 靶标基因重组质粒

4

GBS内参对照品

300µL /支

1支

106Copies/mL内参基因重组质粒

5

GBS阴性对照品

1mL/支

1支

无RNase和DNase水

注:不同批号产品的组分之间不可以混用或互换
需自备试剂:天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)或江苏宏微特斯医药科技有限公司的核酸提取或纯化试剂(磁珠法)(HWTS-3001)、天根生化科技(北京)有限公司的溶菌酶(RT401)、生理盐水、溶菌酶稀释液(20 mM Tris, pH 8.0; 2 mM Na2-EDTA; 1.2% Triton)。
自备试验材料:1.5mL无RNase和DNase的离心管、无RNase和DNase Tip头、台式离心机、台式震荡混合器、磁力架。
【储存条件及有效期】
本试剂盒于-18℃以下避光保存,有效期9个月。开封、反复冻融次数不得多于4次,在低温避光条件下运输,可稳定保存5天。
生产日期、有效期至:见包装盒。
【适用仪器设备】
ABI 7500荧光定量PCR仪、上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪
【样本要求】

  1. 样本采集

1)新鲜采集的生殖道及直肠分泌物拭子样本。
2)对外阴部位多余的分泌物进行擦拭处理,然后以无菌拭子置于阴道的下1/3处并进行旋转以擦拭其多余的阴道分泌物,将采样后的拭子放置于无菌拭子管中,密闭送检;
3)以无菌拭子轻旋肛门括约肌上2-3cm处取直肠分泌物,将采样后的拭子放置于无菌拭子管中,密闭送检;
4)建议上述两种采样后的拭子放置于同一个无菌拭子管中,密闭送检,以提高阳性检出率;
5)建议受检者在取样前一周内避免使用任何抗生素类药品及洗液等。

  1. 存放

待测样本在2-8℃保存不超过7天,-18℃以下保存不超过4个月,-70℃以下保存12个月,样本应避免反复冻融。

  1. 运输

采用泡沫箱加干冰密封运输不超过5天,采用冰袋低温运输不超过3天。
【检验方法】(使用前请仔细阅读本操作流程)

  1. 试剂准备

1.1将GBS核酸反应液、GBS检测酶液室温放置,待试剂充分溶解后,振荡均匀,简短离心。
1.2计算需准备样品数N(N=样本数+1管阴性对照品+1管阳性对照品)。根据所需样品数目N,按照下表配制成反应Mix,按20μL/孔分别加入反应管中,并进行标记;转移至样本处理区。
表1 反应Mix配制表

成分

使用比例

GBS核酸反应液

17μL×N

GBS检测酶液

3μL×N

  1. 样本处理
    1. 向装有拭子标本的无菌管中加入1-3mL灭菌生理盐水,充分震荡混匀,挤干棉拭子,弃棉签。
    2. 吸取1mL液体至1.5mL无RNase和DNase离心管中,12000rpm,离心3min,弃上清留沉淀。
    3. 向沉淀中加入180μL溶菌酶缓冲液(用溶菌酶稀释液将溶菌酶稀释至20mg/mL),吹打混匀,37℃处理30min以上。
    4. 取1.5mL无RNase和DNase的离心管,依次加入200μL阳性对照品、阴性对照品。向待测样本、阳性对照品、阴性对照品中依次加入3μL内参对照品,使用推荐的核酸提取试剂进行后续的样本DNA提取,具体步骤请严格按照说明书进行。建议洗脱体积为100μL。
    5. 提取的样本DNA于95℃加热3min后立即冰浴2min再加样上机检测;或-18℃以下保存,检测前样本DNA 经95℃加热3min后立即冰浴2min处理再加样上机,应避免反复冻融。

注:样本DNA经加热冰浴后,应立即加样上机检测;或立即加样后于2-8℃放置4h内上机检测。

  1. 加样:按10μL/孔加样,离心后上机。
  2. 实时恒温扩增

4.1 仪器通道及反应体积选择
1)选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:None)检测GBS核酸;
2)选择ROX通道(Reporter:ROX,Quencher:None)检测内参;
3)反应体积(Sample Volume)为30µL。具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
4.2 实时恒温扩增条件设定

步骤

温度

时间

循环数

收集荧光信号

1

63℃

1min

30 cycles

  1. 结果分析

5.1 ABI7500荧光定量PCR仪基线及阈值设定方法
基线(baseline)设定:设定某通道基线时,首先选中最小Tt值的待检样本,将选项“☑Auto Baseline”改为“□Auto Baseline”,然后选中“☑Baseline Start,手动调整基线终点至小于样本最小Tt值即可。
阈值(threshold)设定:对各通道阈值应分别进行设定。设定某通道阈值线时,首先选中检测的阴性对照品,去掉勾选的自动阈值线,将选项““☑Auto”改为“□Auto”,然后手动调整阈值线,FAM通道以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准,ROX通道以阈值线刚好超过扩增曲线起峰位置为准。
5.2宏石SLAN-96P全自动医用PCR分析系统基线及阈值设定方法
基线(baseline)设定:在“创建项目”→“实验参数”中的基线起点设为1,终点设为2,FAM和ROX通道基线应分别设定。若待检样本中最小Tt值<2,需根据实际结果进行调整,具体如下:设定某通道基线时,将“基本参数”中的 “基线终点”调至小于最小Tt值即可。
阈值(threshold)设定:对各通道阈值应分别进行设定。设定某通道阈值线时,首先将 “基本参数”中的 “基线优化”设定为手动优化,然后手动调整阈值线,以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

  1. 质量控制:

1)阴性对照品:FAM通道应无扩增,ROX通道Tt值应不大于24。
2)阳性对照品: FAM通道Tt值应不大于28。
以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。
【阳性判断值或参考区间】
采用ROC曲线分析和百分位法对试剂盒检测的临界值进行分析。确定本试剂盒检测B族链球菌的阳性判断值为Tt值<30,内参的Tt值≤24。
【检验结果的解释】

  1. 如果检测样本FAM通道有明显扩增曲线,且Tt值<30,则判断为B族链球菌阳性。
  2. 如果检测样本FAM通道无扩增信号,ROX通道有扩增曲线且Tt值≤24,则判断为B族链球菌阴性;如果检测样本FAM通道无扩增信号,ROX通道有扩增曲线且Tt值>24,建议重新提取后进行检测。
  3. 如果检测样本FAM通道和ROX通道均无扩增信号,建议重新提取样本后进行检测。

【检验方法的局限性】

  1. 本试剂盒检测结果仅供临床参考,对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
  2. 不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果。
  3. 扩增产物的污染和核酸提取中样本间的交叉污染很容易出现假阳性结果,因此临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员,应严格按照说明书要求进行操作。
  4. 检测为阴性,并不代表该患者为非B族链球菌感染患者,具体诊断结果须结合其他临床诊断结果判断。造成检测为阴性的可能是:①不合理样本采集、转运及处理、样本中病原体滴度过低导致检测失败或结果不准确;②检测的靶序列区域出现变异或者其他原因导致的序列改变可能会导致不准确结果;③未经验证的其他干扰因素或者核酸反应抑制因子也可能导致不准确结果等。

【产品性能指标】

  1. 试剂盒外观完好,液体组分清亮、无不溶物。
  2. 试剂盒检测国家阳性参考品GBS1~GBS13或企业阳性参考品P1~P6应均为B族链球菌阳性。
  3. 试剂盒检测国家阴性参考品N1~N10或企业阴性参考品N1~N6应均为B族链球菌阴性。
  4. 试剂盒检测稀释至浓度不高于 1×104 CFU/mL 的国家参考品GBS1、GBS2和GBS5,应均为B族链球菌阳性;最低检测限为1×103Copies/mL。
  5. 重复性:检测稀释至1×107 CFU/mL的国家参考品GBS1、稀释至1×105 CFU/mL的国家参考品GBS5或企业重复性参考品,重复检测10次,应均为B族链球菌阳性,FAM通道CV≤10.0%(n=10);
  6. 试剂盒特异性:检测其他生殖道及直肠拭子样本如白色念珠菌、阴道毛滴虫、沙眼衣原体、解脲脲原体、淋病奈瑟球菌、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、乳酸杆菌、阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌、国家阴性参考品N1-N10(肺炎链球菌、化脓性链球菌、嗜热乳酸链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、大肠埃希菌DH5α、白假丝酵母菌)及人基因组DNA,结果均为B族链球菌阴性。
  7. 亚型检测能力:对B族链球菌血清型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和ND)检出均为阳性。
  8. 试剂盒干扰物:10%全血、常用药物(60mg/mL黏蛋白、50mg/L血红蛋白、70mg/mL白蛋白、60mg/mL红霉素、40mg/L青霉素、30mg/L克林霉素、洁尔阴洗液)对检测不存在干扰。

【注意事项】

  1. 本试剂盒仅用于体外定性检测人的生殖道及直肠分泌物拭子样本中的B族链球菌核酸。实验前请仔细阅读说明书。
  2. 本试剂盒结果会受到样品本身的来源、样品采集过程、样本质量、样本运输条件、样本预处理等因素影响,同时也受到DNA提取质量、荧光定量PCR仪工作状态、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等限制,可能导致得出假阳性或假阴性的检测结果。使用者须了解检测过程中可能存在的潜在错误、准确性的局限性。
  3. 试剂盒应低温运输和保存,试剂盒内各试剂使用前,充分融化并振荡均匀后请短暂离心。避免在不必要的情况下反复冻融。
  4. 本试剂盒所有试剂均经过特别配制,以用于上述检测。随意替换试剂盒中的任何试剂,都可能影响使用效果。不同批号试剂盒成分不可相互混用。
  5. 实验请严格分区操作:

第一区:试剂准备区——准备扩增所需试剂;
第二区:样本处理及加样区——待测样本和对照品处理及加样;
第三区:检测区——PCR扩增检测。
有关实验室管理规范严格按照行政主管部门颁布的有关基因扩增检测实验室的管理规定执行。
各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染;实验后即请清洁工作台。在−18℃以下或−70℃以下保存的样品裂解产物,应在加样前置室温解冻,作短暂离心后使用。

  1. 实验时注意防止外源核酸对试剂的污染,注意先加完样品DNA后再进行阳性对照的操作。推荐在制备反应试剂和添加DNA模板时,使用单独、专用的移液枪和枪头。
  2. 分装有反应液的反应管应扣盖或装入密封袋内再转移至样本处理区。
  3. 上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄漏污染仪器。
  4. 加样时应使样品完全落入反应液中,不应有样品黏附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖。
  5. 扩增完毕立即取出反应管,密封在专用塑料袋内,丢弃于指定地点。
  6. 实验中所用的离心管、Tip头必须保证无RNase和DNase。实验中所用过的离心管、Tip头必须无害化处理。实验中用过的吸头请直接打入盛有84消毒液的废物缸内,并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。
  7. 工作台及各种实验用品定期用75%酒精或紫外灯进行消毒。
  8. 所有化学药品都具有潜在的危险性。操作时,请穿着合适的实验室工作服、并佩戴一次性手套等防护性措施。使用过的试剂盒为临床废弃物,应该妥善处理。

【参考文献】
[ 1] Schrag S , Gorwitz R , Fultzbutts K , et al. Prevention of perinatal group B streptococcal disease. Revised guidelines from CDC.[J]. Pediatric Infectious Disease Journal, 2010, 59(RR-10):1-31. 
[2] 蔡晓沂, 钟镐镐, 王秀艳, et al. 快速、准确的B族链球菌检测——即时荧光探针核酸扩增技术的应用[J]. 现代预防医学, 2013, 40(13).
[3] 李红娟, 王玮, 李宁, et al. 围产期B族链球菌检测方法及预防研究进展[J]. 中国卫生检验杂志, 2018, v.28(11):135-137.
[4] 许庆霞. 孕妇妊娠晚期B族链球菌感染对妊娠结局及新生儿的影响探析[J]. 中国医药科学, 2018, 8(20).
[5] 陈玉秋, 钱雯, 袁琳, et al. 全球B群链球菌流行病学及血清型分布[J]. 中国生物制品学杂志, 2018, 31(12):121-125.
【基本信息】
注册人/生产企业名称:江苏宏微特斯医药科技有限公司
住所:江苏省如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园)
售后服务单位:江苏宏微特斯医药科技有限公司
联系方式:
电话:0513-80562880
传真:0513-80562881
邮编:226400
网址:http://www.hongweitest.com
生产地址:江苏省如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园10号楼一层)
生产许可证编号:
生产日期、生产批号及有效期至见产品包装盒
[医疗器械注册证编号/产品技术要求编号]

[说明书核准日期及修改日期]

关键词:
试剂盒
检测
样本
链球菌
扩增
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  • CE-17.白色念珠菌核酸检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法).pdf

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  • 质量部提供-Dengue virus - DOC.pdf

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  • 图片版-登革热病毒核酸检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)符合性声明DoC.jpg

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