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白色念珠菌核酸检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)

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所属分类:遗传性疾病检测

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白色念珠菌核酸检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)

本试剂盒用于体外定性检测泌尿生殖道样本或临床痰液样本中的白色念珠菌核酸。
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0513-80562880
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产品简介

【产品名称】

  通用名称:白色念珠菌核酸检测试剂盒(酶切探针恒温扩增法)

【包装规格】50 人份/盒

【预期用途】

  本试剂盒用于体外定性检测泌尿生殖道样本或临床痰液样本中的白色念珠菌核酸。

  念珠菌属(Candida species)是人体内最大的真菌正常菌群,在与外界相通的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等器官中广泛存在,一般情况并不致病,属于条件致病菌[1]。由于免疫抑制剂的大量应用,肿瘤放疗、化疗,侵入性治疗,器官移植的开展,以及大量广谱抗生素的广泛应用导致正常菌群失调而引起泌尿生殖道、呼吸道等部位发生念珠菌感染。

  泌尿生殖道念珠菌感染能使女性患念珠菌性外阴、阴道炎和男性念珠菌性龟头、包皮炎及前列腺炎,严重影响患者生活和工作。生殖道念珠菌病的发病率逐年升高,其中女性生殖道念珠菌感染约占 36%左右,男性约占 9%左右,以白色念珠菌(Candida albicans,CA)感染为主,约占 80%左右[2-3]。

  以白色念珠菌感染为典型的真菌感染是导致医院感染死亡的一个重要原因,在 ICU 重症患者中,白色念珠菌感染约占 40%[4-6]。在发生的全部内脏真菌感染中,肺部真菌感染最多, 并且呈逐年增加的趋势,早期诊断鉴别肺部真菌感染具有重要的临床意义[7]。

  目前临床报道的白色念珠菌基因型主要有 A 型、B 型、C 型,这三种基因型的占有率可达 90%以上[8]。准确诊断白色念珠菌感染可以为外阴阴道念珠菌性阴道炎和男性念珠菌性龟头、包皮炎及前列腺炎和呼吸道白色念珠菌感染的诊治提供依据。

  本试剂盒检测结果不作为患者白色念珠菌感染诊断的唯一指标,须结合患者临床特征、影像学检查、其他实验室检查数据,正确判断真菌是感染或定植,制定合理的治疗方案,使抗真菌治疗安全、有效。

【检测原理】

  本试剂盒采用酶切探针恒温扩增技术(Enzymatic Probe Isothermal Amplification,EPIA),针对 CA 的高度保守区域设计特异性引物与含 RNA 碱基的探针(rProbe),同时加入 Bst 酶 及 RNaseH 等,其中 rProbe 的 RNA 碱基左、右两端分别标记荧光基团和淬灭基团。在恒定温度下利用 Bst 酶的 DNA 聚合酶活性和链置换活性扩增待测靶标,RNaseH 酶可切割靶标- 探针杂交链上的 RNA 碱基,使得 rProbe 的荧光基团和淬灭基团分离从而发出荧光。此外, 残留的 rProbe RNA 碱基左侧片段可作为引物继续延伸形成产物,使得产物进一步累积。荧光信号随着产物的形成不断累积,从而实现对目标核酸的检测。

  体系中以重组的松树叶绿体基因质粒作为外源内参,作为对试剂以及操作本身的质控, 避免假阴性。

【主要组成成分】

编号

组成成分
(50 人份/盒)

规格

数量

组成说明

1

CA 核酸反应液

900µL /支

1 支

恒温扩增反应 Buffer、dNTP、水及引物等

2

CA 检测酶液

160µL /支

1 支

恒温扩增 Bst 酶及探针、RNaseH 等

3

CA 阳性对照品

1mL/支

1 支

105Copies/mL 靶标基因重组质粒

4

CA 内参对照品

300µL /支

1 支

104Copies/mL 内参基因重组质粒

5

CA 阴性对照品

1mL/支

1 支

无 RNase 和 DNase 水

  注:不同批号产品的组分之间不可以混用或互换。

  需自备试剂:天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组 DNA 提取试剂盒(DP302)或江苏宏微特斯医药科技有限公司的核酸提取或纯化试剂(磁珠法)(HWTS-3001)、天根生化科技(北京)有限公司的溶菌酶(RT401)、生理盐水、4% NaOH、溶菌酶稀释液(20 mM Tris, pH 8.0; 2 mM Na2-EDTA; 1.2% Triton)。

  自备试验材料:1.5mL 无 RNase 和 DNase 的离心管、无 RNase 和 DNase Tip 头、台式离心机、台式震荡混合器、磁力架。

【储存条件及有效期】

  本试剂盒于-18℃以下避光保存,有效期 9 个月。开封、反复冻融次数不得多于 4 次,在

  低温避光条件下运输,可稳定保存 5 天。生产日期、有效期至:见包装盒。

【适用仪器设备】

  ABI 7500 荧光定量 PCR 仪、宏石 SLAN-96P 全自动医用 PCR 分析系统

【样本要求】

  1. 样本采集

  1.1 泌尿生殖道拭子

  泌尿道分泌物:取尿道分泌物或细小棉签拭子伸入尿道约 2-4cm,略捻拭子取出分泌物。将分泌物或棉签拭子置入无菌管,密闭送检。

  阴道分泌物:在采取患者阴道分泌物的前 24h 内禁止患者进行盆浴、房事与阴道灌洗等, 用无菌棉签小心插到其阴道中,接着轻轻旋转棉签,直至棉签沾满分泌物,最后取出棉签。

  将棉签拭子置入无菌管,密闭送检。

  1.2 痰液

  痰液少者,让患者在晨起后漱口,然后做深呼吸数次,将痰从肺部咳出,收集在干净容器内尽快送检。痰液多者,则先嘱患者轻咳,将潴留在气管内陈旧痰咳出弃去;然后深呼吸数次从肺部深处咳新鲜痰液,立即送检。无痰者,可去医院进行雾化吸入法引痰,然后送检。

  2. 存放

  待测样本在 2-8℃保存不超过 7 天,-18℃以下保存不超过 4 个月,-70℃以下保存 12 个月,样本应避免反复冻融。

  3. 运输

  采用泡沫箱加干冰密封运输不超过 5 天,采用冰袋低温运输不超过 3 天。

【检验方法】(使用前请仔细阅读本操作流程,根据不同样本类型处理样本)

  1. 试剂准备

  1.1 将 CA 核酸反应液、CA 检测酶液室温放置,待试剂充分溶解后,震荡均匀,简短离心。

  1.2 计算需准备样品数 N(N=样本数+1 管阴性对照品+1 管阳性对照品)。根据所需样品数目N,按照下表配制成反应 Mix,按每管 20μL/孔分别加入反应管中,并进行标记,转移至样本处理区。

  表 1 反应 Mix 配制表

成分

使用比例

CA 核酸反应液

17μL×N

CA 检测酶液

3μL×N

  2. 样本处理

  2.1 泌尿生殖道拭子

  2.1.1 向装有拭子标本的无菌管中加入 1-3mL 无菌生理盐水,充分震荡混匀,挤干棉拭子, 弃棉签。

  2.1.2 吸取 1mL 液体至 1.5mL 无 RNase 和 DNase 离心管中(如分泌物较多,只取 0.2mL), 12000rpm,离心 3min,弃上清留沉淀。

  2.1.3 向沉淀中加入 180μL 溶菌酶缓冲液(用溶菌酶稀释液将溶菌酶稀释至 20mg/mL),震荡混匀,37℃处理 30min。

  2.1.4 取 1.5mL 无 RNase 和 DNase 的离心管,依次加入 200μL 阳性对照品、阴性对照品。向待测样本、阳性对照品、阴性对照品中依次加入 3μL 内参对照品,使用推荐的核酸提取试剂进行后续的样本 DNA 提取,具体步骤请严格按照说明书进行。使用无 DNase 和 RNase

  水洗脱,建议洗脱体积为 100μL。

  2.1.5 提取的样本DNA 于 95℃加热 3min 后立即冰浴 2min 再加样上机检测;或-18℃以下保存,检测前样本 DNA 经 95℃加热 3min 后立即冰浴 2min 处理再加样上机,应避免反复冻融。注:样本 DNA 经加热冰浴后,应立即加样上机检测;或立即加样后于 2-8℃放置 4h 内上机检测。

  2.2 呼吸道痰液

  2.2.1 在 1-3mL 痰液中加入 4 倍体积的 4% NaOH,摇匀,震荡混匀,37℃孵育 30min 液化, 13000rpm 离心 15min。去上清,沉淀加无菌生理盐水 1mL 摇匀, 13,000rpm 离心 10min, 弃上清,再重复一次,加入 180μL 溶菌酶缓冲液, 震荡混匀,37℃处理 30min 以上。

  2.2.2 取 1.5mL 无 RNase 和 DNase 的离心管,依次加入 200μL 阳性对照品、阴性对照品。向待测样本、阳性对照品、阴性对照品中依次加入 3μL 内参对照品,使用推荐的核酸提取试剂进行后续的样本 DNA 提取,具体步骤请严格按照说明书进行。使用无 DNase 和 RNase 水洗脱,建议洗脱体积为 100μL。

  2.2.3 提取的样本DNA 于 95℃加热 3min 后立即冰浴 2min 再加样上机检测;或-18℃以下保存,检测前样本 DNA 经 95℃加热 3min 后立即冰浴 2min 处理再加样上机,应避免反复冻融。注:样本 DNA 经加热冰浴后,应立即加样上机检测;或立即加样后于 2-8℃放置 4h 内上机检测。

  3. 加样:按 10μL/孔加样本上机。

  4. 实时恒温扩增

  4.1 仪器通道及反应体积选择

  1) 选择 FAM 通道(Reporter: FAM, Quencher: None)检测 CA 核酸;

  2) 选择 ROX 通道(Reporter: ROX,Quencher: None)检测内参;

  3) 反应体积(Sample Volume)为 30µL。具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。

  4.2 实时恒温扩增条件设定

步骤

温度

时间

循环数

收集荧光信号

1

63℃

1min

30 Cycles

  5. 结果分析

  5.1 ABI7500 荧光定量 PCR 仪基线及阈值设定方法

  基线(baseline)设定:设定某通道基线时,首先选中最小 Tt 值的待检样本,将选项“☑

  Auto Baseline”改为“□Auto Baseline”,然后选中☑Baseline Start,手动调整基线终点至小于

  样本最小 Tt 值即可。

  阈值(threshold)设定:对各通道阈值应分别进行设定。设定某通道阈值线时,首先选中检测的阴性对照品,去掉勾选的自动阈值线,将选项“☑Auto”改为“□Auto”然后手动调整阈值线,FAM 通道以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准,ROX 通道以阈值线刚好超过扩增曲线起峰位置为准。

  5.2 宏石 SLAN-96P 全自动医用 PCR 分析系统基线及阈值设定方法

  基线(baseline)设定:在“创建项目”→“实验参数”中的基线起点设为 1,终点设为 2, FAM 和 ROX 通道基线应分别设定。若待检样本中最小 Tt 值<2,需根据实际结果进行调整。具体如下:设定某通道基线时,将“基本参数”中的 “基线终点”调至小于最小 Tt 值即可。

  阈值(threshold)设定:对各通道阈值应分别进行设定。设定某通道阈值线时,首先将 “基本参数”中的 的基线优化”设定为手动优化,然后手动调整阈值线,以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

  6. 质量控制:

  1) 阴性对照品:FAM 通道应无扩增,ROX 通道 Tt 值应小于 24。

  2) 阳性对照品:FAM 通道 Tt 值应不大于 28。

  以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。

【阳性判断值或参考区间】

  采用 ROC 曲线分析和百分位法对试剂盒检测的临界值进行分析。确定本试剂盒检测白色念珠菌的阳性判断值为 Tt 值<30,内参的 Tt 值<24。

【检验结果的解释】

  1. 如果检测样本 FAM 通道有明显扩增曲线,且 Tt 值<30,则判断为白色念珠菌阳性。

  2. 如果检测样本 FAM 通道无扩增信号,ROX 通道有扩增曲线且 Tt 值<24,则判断为白色念珠菌阴性;如果检测样本 FAM 通道无扩增信号,ROX 通道有扩增曲线且 Tt 值≥24,建议重新提取后进行检测。

  3. 如果检测样本 FAM 通道和 ROX 通道均无扩增信号,建议重新提取后进行检测。

  本检测结果仅供临床参考,不作为感染诊治的唯一依据,阴性结果仅说明低于本试剂盒的检测阈值,但不能排除感染的可能,阳性结果建议结合临床结果进一步诊断。

【检验方法的局限性】

  1. 本试剂盒检测结果仅供临床参考,对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

  2. 不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果。

  3. 扩增产物的污染和核酸提取中样本间的交叉污染很容易出现假阳性结果,因此临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员,应严格按照说明书要求进行操作。

  4. 检测为阴性,并不代表该患者为非白色念珠菌感染患者,具体诊断结果须结合其他临床诊断结果判断。造成检测为阴性的可能是:①不合理样本采集、转运及处理、样本中核酸含量过低导致检测失败或结果不准确;②检测的靶序列区域出现变异或者其他原因导致的序列改变可能会导致不准确结果;③未经验证的其他干扰因素或者核酸反应抑制因子也可能导致不准确结果等。

【产品性能指标】

  1. 试剂盒外观完好,液体组分清亮、无不溶物。

  2. 试剂盒检测提取后企业阳性参考品 P1-P6 均为阳性。

  3. 试剂盒检测提取后企业阴性参考品 N1~N6 均为阴性。

  4. 试剂盒最低检测限为 5copies/µL,102 菌/mL。

  5. 重复性:试剂盒检测提取后重复性参考品 FAM 通道 CV≤10.0%(n=10)。

  6. 试剂盒特异性:与其他泌尿生殖道感染病原如热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、阴道毛滴虫、沙眼衣原体、解脲脲原体、淋病奈瑟球菌、B 族链球菌、单纯疱疹病毒 2 型无交叉。检测呼吸道其他病原感染样本腺病毒、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、麻疹、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌及正常人痰液样本等结果均为阴性。

【注意事项】

  1. 本试剂盒用于体外定性检测泌尿生殖道样本和临床痰液样本中的白色念珠菌核酸。实验前请仔细阅读说明书。

  2. 本试剂盒结果会受到样品本身的来源、样品采集过程、样本质量、样本运输条件、样本预处理等因素影响,同时也受到 DNA 提取质量、荧光定量 PCR 仪工作状态、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等限制,可能导致得出假阳性或假阴性的检测结果。使用者须了解检测过程中可能存在的潜在错误、准确性的局限性。

  3. 试剂盒应低温运输和保存,试剂盒内各试剂使用前,充分融化并振荡均匀后请短暂离心。避免在不必要的情况下反复冻融。

  4. 本试剂盒所有试剂均经过特别配制,以用于上述检测。随意替换试剂盒中的任何试剂,都可能影响使用效果。不同批号试剂盒成分不可相互混用。

  5. 实验请严格分区操作:

  第一区:试剂准备区——准备扩增所需试剂;

  第二区:样本处理区——待测样本和对照品处理; 第三区:加样区——在试剂中加入对应样本和对照品第四区:检测区——扩增检测。

  有关实验室管理规范严格按照行政主管部门颁布的有关基因扩增检测实验室的管理规定执行。各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染;实验后即请清洁工作台。在−18℃以下或−70℃ 以下保存的样品裂解产物,应在加样前置室温解冻,作短暂离心后使用。

  6. 实验时注意防止外源核酸对试剂的污染,注意先加完样品 DNA 后再进行阳性对照的操作。推荐在制备反应试剂和添加 DNA 模板时,使用单独、专用的移液枪和枪头。

  7. 分装有反应液的反应管应扣盖或装入密封袋内再转移至样本处理区。

  8. 反应液分装时应尽量避免产生气泡,上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄漏污染仪器。

  9. 加样时应使样品完全落入反应液中,不应有样品黏附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖。

  10. 扩增完毕立即取出反应管,密封在专用塑料袋内,丢弃于指定地点。

  11. 实验中所用的离心管、Tip 头必须保证无RNase 和 DNase。实验中所用过的离心管、Tip 头必须无害化处理。实验中用过的吸头请直接打入盛有 84 消毒液的废物缸内,并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

  12. 工作台及各种实验用品定期用 75%酒精或紫外灯进行消毒。

  13. 所有化学药品都具有潜在的危险性。操作时,请穿着合适的实验室工作服、并佩戴一次性手套等防护性措施。使用过的试剂盒为临床废弃物,应该妥善处理。

【参考文献】

  [1] 廖万清,吴绍熙.真菌研究进展[M].上海:第二军医大学出版社,1998,11-12.

  [2] Julie van Schalkwyk, MD, Vancouver BCMark H. Yudin, MD, Toronto ON. Vulvovaginitis: Screening for and Management of Trichomoniasis, Vulvovaginal Candidiasis, and Bacterial Vaginosis[J]. J Obstet Gynaecol Can 2015;37(3):266–274.

  [3] 杨继君 陈兴平 万沐芬. 性病门诊患者泌尿生殖道念珠菌感染的临床分析及菌种鉴定[J]. 实用医学杂志,2008,24 (13),2328-2330.

  [4] 中华医学会“念珠菌病诊治策略高峰论坛”专家组.念珠菌病诊断与治疗:专家共识[J]. 中国感染与化疗杂志,2011,11(2):81-95.

  [5] 刘华,付素容. 呼吸内科患者下呼吸道真菌感染类型及感染/定植状况调查分析[J]. 实用医院临床杂志,2015,12(6):90-91.

  [6] 韦莉萍,桂希恩,杨自成等. 医院内真菌深部感染调查及其危险因素分析[J]. 中华医院感

  染学杂志,1988,8(1):28-30.

  [7] 陈赢. 痰真菌培养及涂片镜检查在下呼吸道感染中的价值分析[J]. 中国实用医药,2019,

  14(34):197-198.

  [8] 卓佳,陈柏坤,黄慧燕,等.白色念珠菌临床株基因分型及耐药性研究[J].温州医学院学报,2010,40(1):53-55.

【基本信息】

  注册人/生产企业名称:江苏宏微特斯医药科技有限公司

  住所:江苏省如东县掘港街道珠江路 888 号(如东高新区生命健康产业园) 售后服务单位:江苏宏微特斯医药科技有限公司

  联系方式:

  电话:0513-80562880 传真:0513-80562881

  邮编:226400

  网址:http://www.hongweitest.com

  生产地址:江苏省如东县掘港街道珠江路 888 号(如东高新区生命健康产业园 10 号楼) 生产许可证编号:

  [医疗器械注册证编号/产品技术要求编号]

  [说明书核准日期及修改日期]

关键词:
试剂盒
病毒
受体
结合
变异
突变
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