【产品名称】

　　通用名称：艰难梭菌毒素A/B基因检测试剂盒(荧光PCR法)

【包装规格】50人份/盒

【预期用途】

　　本试剂盒用于体外定性检测艰难梭菌疑似感染患者的粪便样本中的艰难梭菌毒素A基因和毒素B基因。

　　艰难梭菌(Clostridium difficile，CD)是革兰阳性厌氧产孢梭菌，是引起院内肠道感染的主要致病菌之一。临床上，约15%～25%的抗菌药物相关性腹泻、50%～75%的抗菌药物相关性结肠炎和95%～100%的伪膜性肠炎是由艰难梭菌感染(CDI)引起 [1]。艰难梭菌为条件致病菌，包括产毒菌株与非产毒菌株。目前报道只有产毒菌株致病，致病的主要毒力因子为艰难梭菌肠毒素A(tcdA)和细胞毒素B(tcdB)，根据毒素基因型分为3种：A-B-，A-B+，A+B+型[2]。A-B-型菌株不含有毒力基因称为非产毒菌株，A-B+，A+B+型菌株含有毒素基因统称为产毒菌株。艰难梭菌感染患者如不及时治疗，轻则可引起轻度腹泻，重则可危及生命，因此建立一种简便、快速的艰难梭菌检测方法[3]，对艰难梭菌疑似感染患者的临床诊断具有重要意义。

　　本试剂盒用于检测艰难梭菌tcdA基因与tcdB基因，检测结果不得作为患者艰难梭菌感染诊断的唯一指标，必须结合患者临床表现和其他实验室检测结果综合分析。

【检验原理】

　　本试剂盒采用PCR扩增和荧光探针相结合的方法，选择艰难梭菌tcdA基因与tcdB基因的保守区域作为检测靶基因区域，设计荧光检测的特异性引物探针，探针5’端分别标记为FAM(tcdA基因)、CY5(tcdB基因)荧光基团，3’端淬灭基团分别为BHQ1和BHQ2。同时引入外源内参，选择松树叶绿体的一段靶标基因设计荧光检测的特异性引物探针，探针5’端标记为VIC(HEX)荧光基团，3’端淬灭基团为BHQ2。在PCR扩增过程中，tcdA基因、tcdB基因和内参基因的特异性引物和探针分别与各自靶序列结合，通过Taq酶的DNA聚合酶活性和5’-3’ 外切酶活性实现PCR产物形成与荧光信号累积完全同步，实现对样本中的tcdA基因与tcdB基因的定性检测。

【主要组成成分】

注：不同批号试剂盒中各组分不得互换。

需自备试剂：天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）和溶菌酶（RT401）、1×PBS。

自备试验材料：1.5mL无RNase和DNase的离心管、无RNase和DNase Tip头、0.2mLPCR反应管、台式离心机、台式震荡混合器。
【储存条件及有效期】
本试剂盒应避光储存于-18℃以下，试剂盒有效期12个月。反复冻融次数不得多于4次，在-18℃以下的避光条件下运输，可稳定保存5天。
【适用仪器】
ABI7500荧光定量PCR仪、上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪。
【样本要求】

1.样本采集

使用粪便采集器采集艰难梭菌疑似感染患者的粪便样本于一次性无菌容器中，盖紧管盖。标本量要求：
固态样本：采集量约为直径2cm左右的小球大小。
液态样本：采集量约为5mL。

2.存放

待测样本在2~8℃保存不超过5天，-18℃以下保存不超过4个月，-70℃以下长期保存。样本应避免反复冻融。

3.运输

采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输，运输时间最多不超过5天。

【检验方法】

　　1. 试剂准备(试剂准备区)

　　1.1 取出试剂盒各组分，室温放置，待充分溶解后，震荡混匀，简短离心备用。

　　1.2 计算反应液分装个数n=样本数+阴性对照品+阳性对照品，根据所需样本数目n，向PCR反应管中加入25μLCD核酸反应液，压紧管盖，将其转移至样本处理区。用毕的CD核酸反应液立即放入-18℃以下冻存。

　　2. 样本处理(样本处理区)

　　2.1 样本：取约0.5g(黄豆粒大小)的固态样本或200μL液态样本于1.5mL的离心管中，加入700μL的1×PBS，震荡混匀，2000rpm，6min，若为固态样本则取650μL上清待用，若为液态样本则取750μL上清待用。

　　2.2 往沉淀中再加入700μL的 1×PBS，震荡混匀，2000rpm，6min，取650μL上清待用;将两次上清混合，3000rpm，6min，取上清离心，12000rpm，6min，弃上清留沉淀。

　　2.3 向沉淀中加入180μL溶菌酶缓冲液，充分震荡混匀，37℃处理30min以上。

　　2.4 取1.5mL无RNase和DNase的离心管，依次加入180μL阳性对照品、阴性对照品。向待测样本、阳性对照品、阴性对照品中依次加入10μL内参对照品，使用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)的说明书进行后续的样本DNA提取，使用无RNase和DNase水洗脱，建议洗脱体积为100μL。

　　2.5 提取的DNA样本应立即用于检测或-18℃以下保存，保存期限不超过4个月，反复冻融次数不超过4次。

　　3. 加样

　　将步骤2中处理过的待测样本、阳性对照品、阴性对照品分别加入步骤1中分装的CD核酸反应液中，加入量均为5μL，压紧管盖，2000rpm离心10sec。将反应管放入检测仪内，记录加样顺序。

　　4. PCR扩增(检测区)

　　仪器检测通道设定：

　　5. 结果分析

　　5.1 ABI7500荧光定量PCR仪基线及阈值设定方法

　　基线(baseline)设定：基线起点设为3，终点设为15。

　　阈值(threshold)设定：对各通道阈值应分别进行设定。设定某通道阈值线时，首先选中检测的阴性对照品，去掉勾选的自动阈值线，将选项“√Auto”改为“□Auto”，然后手动调整阈值线，以阈值线刚好超过正常阴性对照品FAM/CY5通道扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

　　5.2 上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪基线及阈值设定方法

　　基线(baseline)设定：基线起点设为6，终点设为12。

　　阈值(threshold)设定：对各通道阈值应分别进行设定。设定某通道阈值线时，首先将 “基本参数”中的 “基线优化”设定为手动优化，然后手动调整阈值线，以阈值线刚好超过正常阴性对照品FAM/CY5通道扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

　　6. 质量控制

　　注：以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

【阳性判断值或参考区间】

　　采用ROC曲线分析的方法对试剂盒检测的临界值进行分析。确定本试剂盒检测毒素A/B的阳性判断值为Ct值≤38，内参的Ct值≤35。

【检验结果的解释】

　　当FAM或CY5通道的靶标呈典型S型扩增曲线时，按下表进行结果判断：

　　注：当FAM或CY5通道的靶标为阳性扩增时，VIC(HEX)通道的内参扩增曲线可不做要求。

【检验方法的局限性】

　　1. 本试剂盒检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

　　2. 不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果。

　　3. 扩增产物的污染和核酸提取中样本间的交叉污染很容易出现假阳性结果，因此临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员，应严格按照说明书要求进行操作。

　　4. 检测为阴性，并不代表该患者为非艰难梭菌感染患者，具体诊断结果须结合其他临床诊断结果判断。造成检测为阴性的可能是：①不合理样本采集、转运及处理、样本中病原体滴度过低，②病原体检测靶序列的变异，③未经验证的其他干扰因素如：服用抗菌或病毒药物等，④患者为其他病毒或细菌引起的感染。

【产品性能指标】

　　1. 试剂盒外观完好，液体组分清亮、透明、无不溶物。

　　2. 检测企业阳性参考品P1~P6，其中P1、P2应为艰难梭菌tcdA基因和tcdB基因阳性，P3、P4应为艰难梭菌tcdA基因阳性、tcdB基因阴性，P5、P6应为艰难梭菌tcdA基因阴性、tcdB基因阳性

　　3. 检测企业阴性参考品N1~N6，检测结果均应为阴性。

　　4. 试剂盒最低检测限为200CFU/mL;检测企业检测限参考品S，重复检测20次，至少18次应为艰难梭菌tcdA基因和tcdB基因阳性。

　　5. 重复性：检测企业重复性参考品CV1和CV2，各重复检测10次，均应为艰难梭菌tcdA基因和tcdB基因阳性，且对应通道Ct值的变异系数(CV，%)应不高于5.0%。

　　6. 试剂盒特异性：使用本试剂盒检测其他肠道病原体如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，志贺菌、沙门菌、副溶血弧菌、B族链球菌、艰难梭菌无致病性菌株、腺病毒、轮状病毒、诺如病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒及人基因组DNA，结果均为阴性。

　　7. 干扰试验结果表明，人粪便样本中血红蛋白浓度在不大于50mg/L时，粘蛋白浓度在不大于60 mg/mL时，甘油三酯浓度在不大于400mg/dL时，万古霉素药物浓度在不大于100mg/L时，甲硝唑药物浓度在不大于40mg/L时，干扰素浓度在不大于800 IU/mL时对tcdA基因与tcdB基因的检测无影响。

【注意事项】

　　1. 本试剂盒仅用于体外检测人的粪便样本。实验前请仔细阅读说明书。

　　2. 本试剂盒结果会受到样品本身的来源、样品采集过程、样本质量、样本运输条件、样本预处理等因素影响，同时也受到DNA提取质量、荧光定量PCR仪工作状态、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等限制，可能导致得出假阳性或假阴性的检测结果。使用者须了解检测过程中可能存在的潜在错误、准确性的局限性。

　　3. 试剂盒应低温运输和保存，试剂盒内各试剂使用前，充分融化并振荡均匀后请短暂离心。避免在不必要的情况下反复冻融。

　　4. 本试剂盒所有试剂均经过特别配制，以用于上述检测。随意替换试剂盒中的任何试剂，都可能影响使用效果。不同批号试剂盒成分不可相互混用。

　　5. 实验请严格分区操作：

　　第一区：PCR前准备区——准备扩增所需试剂;

　　第二区：样本处理区——待测样本和对照品处理;

　　第三区：检测区——PCR扩增检测。

　　6. 有关实验室管理规范严格按照行政主管部门颁布的有关基因扩增检测实验室的管理规定执行。

　　7. 各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染;实验后即请清洁工作台。在−18℃以下或−70℃以下保存的样品裂解产物，应在加样前置室温解冻，作短暂离心后使用。

　　8. 实验时注意防止外源核酸对试剂的污染，注意先加完样品DNA后再进行阳性对照的操作。推荐在制备反应试剂和添加DNA模板时，使用单独、专用的移液枪和枪头。

　　9. 分装有反应液的反应管应扣盖或装入密封袋内再转移至样本处理区。

　　10. 反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

　　11. 加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品黏附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。

　　12. 扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。

　　13. 实验中所用的离心管、Tip头必须保证无RNase和DNase。实验中所用过的离心管、Tip头必须无害化处理。实验中用过的吸头请直接打入盛有84消毒液的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

　　14. 工作台及各种实验用品定期用75%酒精或紫外灯进行消毒。

　　15. 所有化学药品都具有潜在的危险性。操作时，请穿着合适的实验室工作服、并佩戴一次性手套等防护性措施。使用过的试剂盒为临床废弃物，应该妥善处理。

　　[参考文献]

　　[1]. 程敬伟, 刘文恩, 马小军,等. 中国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识[J]. 协和医学杂志, 2017, 8(2):131-138.

　　[2]. 王芊, 华川. 艰难梭菌感染的相关研究进展[J]. 临床误诊误治, 2015(8):105-108.

　　[3]. 陈丽丹. 不同来源的艰难梭菌其毒素、MLST分型及药敏情况的分析[D]. 南方医科大学, 2016.

　　[4]. 邵景东, 吴琳, 王毅谦,等. 实时荧光PCR快速检测粪便中艰难梭菌方法[J]. 中国卫生检验杂志, 2011(7):1604-1606.

　　[基本信息]

　　注册人/生产企业名称：江苏宏微特斯医药科技有限公司

　　住所：江苏省如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园)

　　售后服务单位：江苏宏微特斯医药科技有限公司

　　联系方式：

　　电话：0513-80562880

　　传真：0513-80562881

　　邮编：226400

　　网址：http://www.hongweitest.com

　　生产地址：江苏省如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园)10号楼1层

　　生产日期、生产批号及有效期至见产品包装盒

　　[医疗器械生产许可证编号]

　　[医疗器械注册证编号/产品技术要求编号]

　　[说明书核准日期及修改日期]